關(guān)于液相色譜的定量分析

         關(guān)于液相色譜的定量分析   

定量分析是在定性分析的基礎上，需要純物質(zhì)作為標準樣品。液相色譜的定量是相對的定量方法，即：由已知的標準樣品推算出被測樣品的量。

液相色譜法定量的依據(jù)被測組分的量(W)與響應值(A)（峰高或峰面積）成正比,W=f×A。定量校正因子(f)：是定量計算公式的比例常數(shù)，其物理意義時單位響應值（峰面積）所代表的被測組分的量。由已知標準樣品的量和其響應值可以求得定量校正因子。測定未知組分的響應值，通過定量校正因子即可求得該組分的量。定量分析常用術(shù)語：樣品（sample）：含有帶測物，供色譜分析的溶液。分為標樣和未知樣。標樣（standard）：濃度已知的純品。未知樣（unknow）：濃度待測的混合物。樣品量（sample weight）：待測樣品的原始稱樣量。稀釋度（dilution）：未知樣的稀釋倍數(shù)。組分（componance）：欲做定量分析的色譜峰，即含量未知的被測物。組分的量（amount）：被測物質(zhì)的含量（或濃度）。積分（integerity）：由計算機對色譜峰進行的峰面積測量的計算過程。校正曲線（calibration curve）：組分含量對響應值的線性曲線，由已知量的標準物建立，用于測定待測物的未知含量。常用的定量方法1外標法標準曲線法，分為外標法和內(nèi)標法。外標法在液相色譜中用的zui多。內(nèi)標法準確但是麻煩，在標準方法中用的zui多。用被測化合物的純品作為標準樣品，配制成一系列的已知濃度的標樣。注入色譜柱的到其響應值（峰面積）。 
在一定范圍內(nèi)，標樣的濃度與響應值之間存在較好的線性關(guān)系，即W=f×A，制成標準曲線。

在*相同的實驗條件下，注入未知樣品，得到欲測組分的響應值。根據(jù)已知的系數(shù)f，即可求出欲測組分的濃度。

 

外標法的優(yōu)點：操作、計算簡單，是一種常用的定量方法； 無需各組分都被檢出、洗脫；需要標樣；標樣及未知樣品的測定條件要一致；進樣體積要準確。
外標法缺點：實驗條件要求高，如檢測器的靈敏度，流速、流動相組成的不能發(fā)生變化；每次進樣體積要有好的重復性。2內(nèi)標法

操作：

將已知量的內(nèi)標樣加入標準樣品，制成混合標樣，并配制一系列的已知濃度的工作標樣?；旌蠘藰又袠藰优c內(nèi)標樣的摩爾比不變。注入色譜柱，以（標樣峰面積/內(nèi)標樣峰面積）為響應值。根據(jù)響應值與工作標樣濃度之間存在的線性關(guān)系，即W=f×A，制成標準曲線。

將已知量的內(nèi)標樣加入未知樣品，注入色譜柱，得到欲測組分的響應值。根據(jù)已知的系數(shù)f，即可求出欲測組分的濃度。
內(nèi)標法的特點：操作過程中樣品和內(nèi)標是混合在一起注入色譜柱的，因此只要混合溶液中被測組分與內(nèi)標的量的比值恒定，上樣體積的變化不會影響影響定量結(jié)果。內(nèi)標法抵消了上樣體積，乃至流動相、檢測器的影響，因此比外標法。案例分析案例分析一我做的是苯酚羥基化反應，產(chǎn)物中有苯酚，苯二酚（鄰，對），苯醌，焦油，用安捷倫1100液相色譜分析，外標法計算選擇性和轉(zhuǎn)化率。但一直以來，計算出的結(jié)果老是差強人意。偶爾算出一個好的結(jié)果，但是一重復又不行了，有時候重復做幾次都不一樣，很是郁悶。zui近又老算出來選擇性超過100%。開始懷疑稀釋誤差的問題（樣品是稀釋以后去測的)，但現(xiàn)在操作的時候非常小心了，懷疑標準曲線的問題，但是重新做了好幾條了。結(jié)果就是很奇怪，自己想了想：1.因為液相色譜儀是公用的，所以特意買了的色譜柱。但經(jīng)常測的時候發(fā)現(xiàn)柱壓不一樣，是不是因為這個影響了峰面積，進而影響了結(jié)果？柱壓的影響這么大么？2.是不是外標法就不準確？該用單點校正法？之前覺得每次測樣前都配一個標樣有點麻煩，所以沒用。3.還是別的什么原因？補充：用的柱子是ZORBAX SB-C18, 用的甲醇：水=3：7，每個峰都分的很開。取樣后離心去掉催化劑，再定量稀釋然后去測的。

網(wǎng)友七嘴八舌：

 

- 有時候確實柱壓不同會對結(jié)果有影響，但這是柱壓差別很大的情況才會發(fā)生。是不是柱子沒沖洗好，或者需要看是否進氣泡了，因為這都可能導致結(jié)果不準。

- 如果柱壓的差別很大的話，比如30bar已經(jīng)很大了，平時用的時候，有柱溫箱，一般都控制溫度恒定的，基本同意條件不會有這么大的變化，zui多10bar上下浮動，通常小于5bar。

- 是不是走過緩沖鹽的流動相？用水低流速長時間沖洗，再換乙腈沖洗試試看。是不是有些不物殘留在柱子中沒有及時沖洗導致柱壓偏高，可以嘗試用異丙醇試試。

- 柱壓變化主要會影響保留時間，對峰面積影響不大。你所說的重復性不好，是液相進同一個樣品重復不好還是不同的樣品。如果不同的樣品那是你反應的問題。至于選擇性超過100%？是否是計算方法錯誤？

- 簡單來說，計算苯二酚的選擇性：

假設對苯峰面積代入標準曲線得濃度C1(g/ml)；鄰苯峰面積對應濃度C2，苯酚峰面積對應濃度C，溶液總體積V，稀釋倍數(shù)20，初始苯酚加入量m(g),如下

 

- 計算公式如果沒錯，可以看看是否自己沒有做過空白以及反應投料時的組分測試。

- 至于單點還是外標法？

單點校正比較簡單，如果要求不是很嚴格的話，單點校正可以滿足要求。單點標準濃度如果在被測樣品濃度附近，結(jié)果比外標法更準確。做考核樣時，我們一般先用外標法定出大致濃度范圍，再以單點法定量。

單點一般適用于線性曲線截距在100%濃度點2%以下的。高于20%不能采用單點校正和外標。外標法對照和拱式樣品濃度應一致，校正曲線線性符合即可。

案例分析二我想用液相色譜進行定量分析，使用外標法。問題是：標準曲線是不是每次測定樣品時都要做一次？我有200個樣品，但不是一次能做好，每次我可以測20個樣品。難道我每次測定前都要先做一下標準曲線？我是同一臺儀器，同一條件。網(wǎng)友七嘴八舌：

從嚴格意義上來講應該是每天做一條標準曲線。如果你做的東西要求不是太嚴格（不需要報批），可以考慮隔幾天做一天標曲。不可否認的是，每天都做標準曲線能減小測量的數(shù)據(jù)的誤差。

但是如果是藥品檢測，是應該每次開機測定樣品前做一條標準曲線或單點校正標準溶液分析，但普通化工分析要求不嚴就沒有必要每次做曲線，因為差異不大的。但如果是檢測單位檢測樣品，就要根據(jù)標準來執(zhí)行了。說白了其實是規(guī)范不規(guī)范的問題。