如何判斷一只色譜柱的“退休”時(shí)間？

如何判斷一只色譜柱的“退休”時(shí)間？

色譜工作者常會(huì)碰到這樣的問(wèn)題，色譜柱的塔板數(shù)能體現(xiàn)色譜柱的狀態(tài)嗎?如何確定一支色譜柱是否應(yīng)該“退休”？新的色譜柱在使用前都要做什么？如何對(duì)柱子進(jìn)行清洗？好的色譜柱應(yīng)具備哪些性能？等等一系列問(wèn)題，都是今天要和您探討的！

新色譜柱開(kāi)啟和安裝推薦步驟

 

1.使用新鮮潔凈的水與乙腈。沖洗系統(tǒng)，確保系統(tǒng)干凈，不含任何緩沖鹽和污染物。

2.取用色譜柱時(shí)避免磕碰掉落。

3.將色譜柱入口端連接到系統(tǒng)上，柱出口端先不要連接，色譜柱身上有箭頭標(biāo)明正確流向。

4.在0.1mL/min流速條件下用純乙腈潤(rùn)洗色譜柱，然后在2分鐘內(nèi)將流速升至0.5mL/min。

5.當(dāng)溶劑均勻的從柱出口端流出，停流速，將色譜柱出口端接到系統(tǒng)檢測(cè)器上（這樣可以避免氣泡進(jìn)入檢測(cè)系統(tǒng)，并且可快速達(dá)到基線(xiàn)平衡）。

6.重啟流速，按照步驟4的方法逐漸提高流速，至常規(guī)分析時(shí)所使用的流速。

7.參考柱效測(cè)試報(bào)告中的方法，使用該流動(dòng)相條件平衡色譜柱，通常需要使用5-10倍柱體積的流動(dòng)相，直至壓力與基線(xiàn)穩(wěn)定。

8.測(cè)試柱效。如果沒(méi)有柱效測(cè)試報(bào)告中的分析物，請(qǐng)聯(lián)系廠家部門(mén)尋求支持，使用合適的濃度與進(jìn)樣量。柱效結(jié)果略低于柱效測(cè)試報(bào)告屬正常情況。如結(jié)果明顯偏低、峰形拖尾，提示色譜柱和/或所使用的液相系統(tǒng)處于非理想狀態(tài)，需要進(jìn)行故障排查。當(dāng)使用2.1mm內(nèi)徑色譜柱時(shí)，建議優(yōu)化系統(tǒng)以減少譜帶展寬，包括：使用檢測(cè)器微量流通池，減少進(jìn)樣器loop環(huán)體積，使用較小內(nèi)徑（如0.005''或0.12mm）的系統(tǒng)管路。并確保管路與色譜柱連接恰當(dāng)、無(wú)死體積。當(dāng)使用小顆粒填料（如2.5μm）短柱進(jìn)行快速分離時(shí)，

 

需要考慮以下因素：

1.確保管路與色譜柱連接恰當(dāng)、無(wú)死體積，盡量?jī)?yōu)化系統(tǒng)減少譜帶展寬；

2.提高采樣頻率至10點(diǎn)/秒以上；

3.較小粒徑的色譜柱產(chǎn)生的柱壓較高，而較小粒徑要達(dá)到色譜效率所需的線(xiàn)速度較高，請(qǐng)根據(jù)所用LC系統(tǒng)的實(shí)際情況調(diào)節(jié)流速；

4.可使用較高的柱溫來(lái)補(bǔ)償小顆粒造成的壓力升高，例如40?C。使用雜化顆粒反相色譜柱時(shí)，可使用45?C或更高。

 

使用反相C18色譜柱總結(jié)的一些小經(jīng)驗(yàn)

 

1、新柱的處理：我們每次新買(mǎi)的柱子雖然是經(jīng)廠家測(cè)試過(guò)并密封好的，可是有的柱子到達(dá)手中時(shí)已經(jīng)過(guò)很長(zhǎng)的時(shí)間了，因此，我們每拿到一根新的色譜柱都必須要對(duì)柱子進(jìn)行處理。首先，是配制好65%的乙腈/水，再把色譜柱正確的連接在色譜儀上，出口放空（注意：出口端切不可連上檢測(cè)器，以免污染了檢測(cè)器），以低流速0.1ml/min~0.5ml/min（如果是LC/MC柱子，則應(yīng)以0.3ml/min進(jìn)行）均可，不可以高流速進(jìn)行，等看見(jiàn)柱子出口有液體流出后，過(guò)20分鐘后再接上檢測(cè)器，以循序漸進(jìn)的方法將流速調(diào)至1.0ml/min（如果是LC/MC柱子則應(yīng)以0.3ml/min進(jìn)行），繼續(xù)沖洗2~8小時(shí)。

 

2、新柱的使用：首先我們確認(rèn)所分析樣品流動(dòng)相的PH是不是在色譜柱PH的耐受范圍之內(nèi)，以免損傷柱子!如果，確認(rèn)在柱子的使用范圍之內(nèi)，就用做樣品的流動(dòng)相平衡柱子(如果流動(dòng)相中含用緩沖鹽溶液，在平衡柱子之前務(wù)必要先用5%甲醇或5%乙腈去過(guò)渡30分鐘以上。再用帶鹽的流動(dòng)相去平衡色譜柱。)當(dāng)色譜柱平衡了足夠時(shí)間，基線(xiàn)非常平穩(wěn)的時(shí)候，方可進(jìn)樣分析。不管是分析什么樣的產(chǎn)品，由于各種各樣的因素，樣品中總有雜質(zhì)。因此，在色譜柱前端加上保護(hù)柱。以增加色譜柱的使用壽命！

 

3、色譜柱清洗：①如果樣品分析中只用到一般的乙腈、甲醇和水的流動(dòng)相，在做完樣品之后可直接用55%~65%乙腈/水或者用55%~65%甲醇/水沖洗色譜柱40~80分鐘，然后以純甲醇或乙腈沖洗30分鐘，即可保存；②如果樣品分中流動(dòng)相里含用緩沖液或酸或離子對(duì)試劑的流動(dòng)相，在做完樣品之后的清洗必須按照如下步驟進(jìn)行清洗柱子:先用5%的甲醇/水或5%的乙腈/水，以1ml/min,沖洗1.5小時(shí)以上(如果色譜柱更長(zhǎng)，則還需要增加適當(dāng)時(shí)間);然后用55%甲醇/~水65%/水沖洗色譜柱30~60分鐘.后用甲醇或乙腈以1ml/min沖洗30分鐘。

 

4、色譜柱的再生：當(dāng)色譜柱用過(guò)很長(zhǎng)的時(shí)間之后，就可能發(fā)生柱壓力升高、分離度不好、柱效降低、峰形不好等等情況，這時(shí)我樣就需要對(duì)色譜柱進(jìn)行再生，以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。具體方法有如下兩種：①先用5%甲醇/水或者是5%乙腈/水，把色譜柱反向以1ml/min,沖洗60分鐘以上.然后以1ml/min沖洗30分鐘以上；再用65%甲醇/水或者65乙腈/水，以流速1ml/min沖洗60分鐘。后用純甲醇或乙腈沖洗30分鐘保存即可。

 

什么時(shí)候該換新柱了？

 

1.當(dāng)柱子塔板數(shù)降低到新柱子百分之幾時(shí)該換？

色譜工作者常會(huì)碰到這樣的問(wèn)題，什么時(shí)候該換色譜柱了?色譜柱的塔板數(shù)能體現(xiàn)色譜柱的狀態(tài)嗎?確定表明一支色譜柱應(yīng)該“退休”的標(biāo)準(zhǔn)，從經(jīng)驗(yàn)來(lái)看，當(dāng)一支色譜柱的塔板數(shù)降低到新柱子時(shí)的百分之多少時(shí)就可以認(rèn)為該色譜柱不能再使用了呢?將塔板數(shù)作為評(píng)價(jià)色譜柱質(zhì)量的指標(biāo)合適嗎?在您的實(shí)驗(yàn)室里是如何判斷一根色譜柱不可以再用了呢?

塔板數(shù)是一個(gè)粗略的指標(biāo)，不能作為評(píng)價(jià)色譜柱的標(biāo)準(zhǔn)。通常使用塔板數(shù)來(lái)考察色譜系統(tǒng)：將新柱子接到儀器上，根據(jù)色譜柱生產(chǎn)商提供的測(cè)試條件測(cè)試該色譜柱，你應(yīng)該得到和分析報(bào)告上同樣的結(jié)果。差也應(yīng)該得到比報(bào)告值低10%的塔板數(shù)。如果你所測(cè)得的塔板數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于廠家提供的報(bào)告數(shù)據(jù)，這就說(shuō)明你的色譜系統(tǒng)可能存在一些問(wèn)題。進(jìn)樣器、柱外效應(yīng)、毛細(xì)連接以及檢測(cè)器都是容易出現(xiàn)問(wèn)題的地方。

 

2.使用壓力、分辨率和峰形的混合指標(biāo)來(lái)考察一根色譜柱的狀態(tài)

相信每個(gè)色譜工作者都會(huì)關(guān)心分辨率，分辨率是考察一根色譜柱分離具體樣品的好壞程度指標(biāo)。 然而，我們需要考慮的另一個(gè)因素是塔板數(shù)對(duì)分辨率的影響僅僅是平方根的關(guān)系，這意味著當(dāng)一根色譜柱的塔板數(shù)下降50%，分辨率僅僅下降7%。而當(dāng)一根色譜柱塔板數(shù)下降為新柱子一半的時(shí)候，你肯定看到了其它更加嚴(yán)重的癥狀告訴你這根色譜柱的壽命不長(zhǎng)了。在實(shí)際的工作中，大多數(shù)色譜方法僅僅需要這些塔板數(shù)的一半，這些色譜方法還有優(yōu)化的空間嗎?答案是肯定的?？梢?jiàn)，色譜柱的塔板數(shù)不是分離中重要的參數(shù)。

 

較好的方法是使用壓力、分辨率和峰形的混合指標(biāo)來(lái)考察一根色譜柱的狀態(tài)。

（1）.壓力的測(cè)量：是容易的，通常我們確定的色譜方法要滿(mǎn)足以下的要求：用新柱子時(shí)柱壓不高于2500psi，在任何情況下壓力都不超過(guò)3000psi。盡管現(xiàn)代的液相色譜系統(tǒng)都可在更高的壓力下使用，但由于高壓產(chǎn)生的系統(tǒng)損耗和泄漏的問(wèn)題會(huì)很?chē)?yán)重。當(dāng)壓力超過(guò)3000psi時(shí)，考慮更換進(jìn)樣器和色譜柱之間的0.5mm孔徑的在線(xiàn)濾片。如果更換濾片后壓力仍然高，則色譜柱的濾片或者是色譜柱已經(jīng)被污染，這提示我們?cè)摀Q柱子了。有統(tǒng)計(jì)表明，超過(guò)60%的色譜柱損壞是由于壓力過(guò)高的原因。

 

（2）.分辨率：是我們考察色譜柱的一個(gè)非常重要的指標(biāo)，只要兩個(gè)組分可以獲得基線(xiàn)分離，對(duì)該分析物的定量就不會(huì)有什么問(wèn)題。對(duì)于對(duì)稱(chēng)的高斯峰來(lái)講，1.5的分辨率即可得到基線(xiàn)分離;若Rs在1.7至2.0之間則更好。若峰拖尾嚴(yán)重則需要更高的分辨率。使用分辨率作為色譜柱的評(píng)價(jià)指標(biāo)的好處在于我們可以直觀地看到相鄰的峰的分離情況。

 

（3）峰形拖尾：另:一個(gè)考察色譜柱質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)是峰形拖尾情況，廠家測(cè)試報(bào)告的峰形都非常漂亮，但這并不代表該色譜柱分析實(shí)際樣品的情況。實(shí)際樣品中總是含有或多或少引起峰形拖尾的組分。值得一提的是含有氮原子的化合物，這些化合物和硅膠骨架上的游離硅羥基結(jié)合非常緊密，隨著色譜柱使用時(shí)間越長(zhǎng)，鍵合相流失，拖尾則更加嚴(yán)重。然而拖尾情況的改變不像分辨率的改變那樣能夠馬上看出來(lái)。基于此，定一個(gè)拖尾因子的上限，如美國(guó)藥典規(guī)定拖尾因子不超過(guò)1.8。

 

3.確定色譜柱“拋棄”標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間

確定色譜柱“拋棄”標(biāo)準(zhǔn)的時(shí)間是當(dāng)我們開(kāi)發(fā)分析方法或作方法認(rèn)證的時(shí)候。通常，在開(kāi)發(fā)分析方法的過(guò)程中你會(huì)試驗(yàn)幾根色譜柱，分析足夠多的實(shí)際樣品，你知道當(dāng)分離變差的時(shí)候是什么樣的情況。我傾向于在開(kāi)始時(shí)使用一個(gè)寬的范圍。我們的經(jīng)驗(yàn)是這樣的：你如果在開(kāi)始時(shí)緊縮系統(tǒng)適用性要求，在方法認(rèn)證后再放寬這個(gè)要求是很困難的。在分析實(shí)際樣品之前進(jìn)行系統(tǒng)適用性考察，以確保該色譜方法滿(mǎn)足分析者可以接受的標(biāo)準(zhǔn)。

 

那么，好的色譜柱應(yīng)該具備的性能有哪些？

 

 

網(wǎng)友經(jīng)驗(yàn)談：新買(mǎi)的C18色譜柱用前該如何處理？

 

首先用甲醇或乙腈沖洗，大約20倍柱體積，除新柱子中的有機(jī)雜質(zhì)。然后用10%甲醇或乙腈沖洗10倍柱體積（相比較而言，乙腈價(jià)格比甲醇貴，所以一般用甲醇沖洗，大約4小時(shí)就可以了）。進(jìn)行流動(dòng)相過(guò)度，然后就可以運(yùn)行你的流動(dòng)相體系了。用完之后，如果流動(dòng)相中有緩沖鹽，要用10%甲醇沖洗20倍柱體積，如果長(zhǎng)期不用，保存在出場(chǎng)溶劑中，短期不用，不用處理，密封后柱子就OK了。

如果馬上就用，（1）使用的流動(dòng)相中有緩沖鹽，需用一定百分比的甲醇（如：10%甲醇）沖洗半小時(shí)，進(jìn)行流動(dòng)相過(guò)度，然后就可以運(yùn)行你的流動(dòng)相體系了；（2）使用的流動(dòng)相無(wú)緩沖鹽，如甲醇-水（1:1），可直接換流動(dòng)相，待基線(xiàn)平穩(wěn)后可直接進(jìn)樣。

 

網(wǎng)友經(jīng)驗(yàn)談：新柱子要充分平衡

 

反相色譜柱在經(jīng)過(guò)出廠測(cè)試后是保存在乙腈-水中的；由于色譜柱在儲(chǔ)存或運(yùn)輸過(guò)程中固定相可能會(huì)干掉，影起鍵合相的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。因此新柱子要充分平衡。

 

反相色譜柱的平衡方法：

1.以乙腈或甲醇（是色譜純的）為流動(dòng)相，流速：0.2mL/min 沖一夜(小流速過(guò)夜沖就行)。

2.流速改為0.8mL/min 沖上30min直到基線(xiàn)水平為止（正常流速?zèng)_）。

3.使用時(shí)替換成流動(dòng)相沖基線(xiàn)平了就可以用了。

正相：改用正庚烷或正己烷。（同同反相）以上均為硅膠鍵合相色譜柱！